L’analisi del Liquido sinoviale nella diagnosi delle infezioni di protesi articolare

Le infezioni periprotesiche rappresentano una complicanza rilevante nella chirurgia ortopedica con una incidenza dello 0,3-2,5% in caso di primi impianti ma che può aumentare fino al 10% in caso di impianto precedentemente revisionata. Il loro trattamento richiede prolungate terapie antibiotiche, molteplici interventi chirurgici per la rimozione e la sostituzione della protesi infetta con conseguenze importanti sulla qualità della vita del paziente con una frequenza significativamente più elevata che nei pazienti sottoposti a interventi di revisione di protesi non infetta. In aggiunta all’impatto sul singolo individuo, si devono tenere presenti le ricadute a livello socio-economico sul sistema sanitario per gli ingenti costi che le infezioni di protesi articolare comportano. Inoltre, in prospettiva è stato stimato che nei prossimi anni l'invecchiamento della popolazione e il miglioramento delle procedure chirurgiche comporteranno un aumento del numero degli interventi di protesi articolare e, di conseguenza, anche i pazienti con infezione protesica.

Diventa perciò evidente come una precoce diagnosi di infezione diventa essenziale per garantire una appropriata e tempestiva cura del paziente, evitando inutili e costosi trattamenti antibiotici. La diagnosi di infezione protesica coinvolge diverse figure professionali, quali microbiologo, il chirurgo ortopedico, l’infettivologo e, dal momento che non è stato ancora individuato un indicatore univoco dotato di sufficiente sensibilità e specificità, si basa sulla valutazione congiunta di diversi parametri sia clinici che di laboratorio. La diagnosi è ulteriormente complicata dal fatto che, nel tempo, col progredire delle conoscenze, sono stati pubblicati diversi criteri per la definizione di infezione di protesi articolare, non sempre sovrapponibili tra loro. Tra i criteri maggiormente utilizzati vi sono quelli definiti dalla Muskulosckeletal Infection Society (MSIS) nel 2011, dalla Infectious Disease Society of America (IDSA), nel 2013 e dall’ International Consensus Meeting di Philadelphia (ICM) nel 2013 e aggiornati nel 2018. La più recente e dettagliata definizione di infezione di protesi articolare è quella pubblicata dalla European Bone and Joint Society, che individua tre classi di probabilità di infezione: Improbabile, Probabile e Confermata, basandosi sulla soddisfazione di una serie di criteri sia clinici, che laboratoristici che radiologici. Seppure utilizzando diversi criteri e diversi valori soglia, tutti i criteri elencati evidenziano l’analisi del liquido sinoviale come essenziale per la diagnosi di infezione protesica. Il liquido sinoviale si presta a molteplici analisi di laboratorio dalla conta leucocitaria e relativa differenziazione in cellule mononucleate (MN) e polimorfonucleate (PMN), alla misurazione di biomarcatori indice di infezione protesica e all’esame colturale per isolare e identificare l’agente patogeno. Inoltre, esso può essere prelevato in fase pre-operatoria permettendo di ottimizzare il trattamento del paziente senza attendere i risultati degli esami intra-operatori. Al fine di ottimizzare le informazioni ottenibili dall’analisi del liquido sinoviale in particolare dall’esame colturale, eventuali terapie antibiotiche in essere dovrebbero essere sospese almeno 15 giorni prima del prelievo che può essere effettuato sotto guida ecografica.

Conta leucocitaria

La conta dei leucociti nel liquido sinoviale è stata sempre inclusa come criterio diagnostico nelle diverse definizioni di infezione protesica. Infatti, sono stati riportati elevati valori di sensibilità e di specificità, superiori al 90%. La sua esecuzione è alla portata di tutti i laboratori necessitando di un analizzatore ematologico validato per liquidi biologici o se la strumentazione non è disponibile, di un microscopico ottico. In letteratura sono stati riportati valori soglia per la diagnosi di infezione variabili tra 1500 e 3000 cellule/µL con una frazione di PMN tra il 65 e l’80%. Diversi studi concordano sul fatto che valori inferiori a 1500 cellule/µL o PMN% <65% indicano l’infezione come altamente improbabile, così come una conta leucocitaria >3000 cellule/µL con una frazione di PMN >80% sono suggestivi di un quadro infettivo. Conte leucocitarie comprese tra 1500 e 3000 cellule/µL risultano di difficile interpretazione e devono essere integrate dalla misurazione di altri parametri (es. Biomarcatori) o dall’esame colturale. Vi sono tuttavia altre condizioni, quali ad esempio artrite infiammatoria o metallosi, che possono causare conte elevate. Anche in questi casi, la determinazione di biomarcatori a livello sinoviale può fornire utili informazioni per l’interpretazione del quadro clinico

Biomarcatori

Nel corso degli anni, alla ricerca di un parametro definitivo in grado di identificare con elevata sensibilità e specificità un’infezione protesica, sono stati proposti diversi marcatori, alcuni dei quali vengono comunemente utilizzati nella pratica routinaria, avendo trovato ampio consenso nella comunità scientifica. Teoricamente, il biomarcatore ideale dovrebbe essere caratterizzato da elevata sensibilità (la capacità di individuare i soggetti malati) e specificità (la capacità di individuare i soggetti che non presentano la malattia), semplicità di esecuzione e interpretazione e da un favorevole rapporto costo/beneficio.

Esterasi Leucocitaria

L’esterasi è un enzima rilasciato dai leucociti attivati richiamati a livello articolare dalla presenza di un importante processo infiammatorio/infettivo con la funzione di degradare le proteine che supportano la matrice connettivale. Ampiamente utilizzato come indice di infezione nell’ esame chimico fisico delle urine, la sua presenza risulta strettamente correlata alla presenza di leucociti. La sua misurazione viene effettuata mediante un test colorimetrico, utilizzando le tradizionali strisce reattive utilizzate per l’analisi delle urine. Il risultato ottenuto è semiquantitativo derivando dalla lettura dell’intensità del colore sviluppato in seguito alla reazione: incolore (negativo), 1+, 2+ o 3+. Utilizzando un valore soglia 2+, il test ha dimostrato una sensibilità variabile da 81 a 93% e una specificità del 97-100%. La sensibilità aumenta fino al 97% qualora si abbassi il valore soglia a 1+, a scapito però della specificità (84-96%). Il test, tuttavia, risente della presenza di eritrociti che possono interferire con la reazione colorimetrica e, pertanto, può essere necessario centrifugare il campione per 10-15 minuti. I principali vantaggi del test sono i costi limitati, la rapidità di risposta (circa 20-25 minuti, inclusa la centrifugazione del campione) e la semplicità di esecuzione, caratteristiche che lo rendono utilizzabile anche in estemporanea durante l’intervento di revisione. Come per altri test basati sulla determinazione di prodotti correlati alla presenza di leucociti, il test dell’esterasi leucocitaria può dar luogo a risultati falsi positivi in casi di processi infiammatori severi a carico dell’articolazione. In questi casi può essere utile associare combinare la determinazione dell’esterasi ad altri marcatori per aumentarne la specificità.

Proteina C Reattiva

La proteina C reattiva (PCR) misurata soprattutto a livello sierico è uno di marcatori di infiammazione più utilizzati per la diagnosi di infezione. Sebbene sintetizzata principalmente a livello epatico, la PCR è in grado di depositarsi nei siti di infiammazione e di tessuti danneggiati dove si lega ai residui di lisofosfatidilcolina presenti sulla superficie di cellule morte allo scopo di attivare il complemento. Di conseguenza, livelli elevati di PCR nel liquido sinoviale sono considerati un indice sensibile e specifico di infezione protesica. La sua determinazione può essere effettuata sui comuni analizzatori di chimica clinica sul campione centrifugato e pertanto non richiede strumentazioni particolari o personale dedicato e i costi sono limitati. Tuttavia, la maggior parte dei metodi per analizzatori automatici non è stata validata per poter essere utilizzata con liquido sinoviale, motivo per il quale ogni laboratorio dovrebbe procedere autonomamente alla validazione analitica del metodo utilizzato. Di conseguenza, non sono disponibili sufficienti dati per definire un valore soglia univoco per procedere alla diagnosi di infezione e i dati riportati in letteratura evidenziano una notevole variabilità per sensibilità (84 – 92%) e specificità (71-98%).

Alfa-defensina

L’alfa-defensina è un peptide di piccole dimensioni (29-34 aminoacidi) con attività antibatterica prodotta dai granulociti neutrofili in risposta all’infezione. Appartiene a una famiglia di proteine, le defensine, molto antiche e diffuse in natura con una struttura conservata in mammiferi, insetti e piante. Esse agiscono inserendosi nella membrana cellulare, alterando la sua struttura con formazioni di pori e portando a morte cellulare. Attualmente sono disponibili due differenti test per la determinazione di alfa-defensina nel liquido sinoviale con diversa accuratezza diagnostica. Il primo utilizzando una metodica ELISA fornendo un risultato quantitativo risulta marcatamente più sensibile del secondo basato su un saggio immunocromatografico (92-100% vs 43-97%). Per entrambi i test è stata riportata un’elevata specificità (93-100%). Queste caratteristiche unitamente al costo elevato rendono la determinazione di alfa defensina maggiormente un test di conferma da utilizzarsi per casi dubbi piuttosto che un test di screening per diagnosi di infezione protesica. Analogamente a quanto descritto per la determinazione dell’esterasi leucocitaria, anche la misurazione di alfa-defensina può dare luogo a risultati falsi positivi in pazienti affetti da patologie infiammatorie non di natura infettiva.

Calprotectina

La calprotectina è una proteina appartenente alla classe delle proteine leganti il calcio e lo zinco ad attività antimicrobica, presente soprattutto nei granulociti neutrofili, nei macrofagi e nei monociti. In caso di infezione, l’accumulo di granulociti neutrofili nel sito di infezione porta a un rilascio di calprotectina con conseguente aumento della sua concentrazione a livello sinoviale. Essendo stata proposta recentemente per la diagnostica di infezione protesica, i dati attualmente disponibili sono limitati e non permettono di definire un valore soglia di riferimento. Per la misurazione di calprotectina può essere utilizzato lo stesso sistema che viene routinariamente impiegato per la sua determinazione nelle feci con costi contenuti) o un kit dedicato alla sua misurazione ma molto più costoso. In ogni caso, sono stati riportati valori di sensibilità e specificità superiori al 90% che rendono la determinazione della calprotectina uno strumento promettente per la diagnosi di infezione di protesi, in attesa di ulteriori studi.

Interleuchina-6 (IL-6)

L’ interleuchina 6 è una citochina pro-infiammatoria in grado di promuovere il differenziamento dei neutrofili dei linfociti B e di stimolare la produzione delle proteine di fase acuta. Il dosaggio di IL-6 nel liquido sinoviale è stato proposto recentemente come marcatore di infezione protesica in quanto sembra essere più specifico di quello nel siero. I dati riportati evidenziano una buona specificità per il dosaggio nel liquido sinoviale (85,7-100%), cui corrisponde una sensibilità estremamente variabile 62,5 - 100%. La specificità del test è ridotta in pazienti con artrite reumatoide. Tuttavia, i dati disponibili non sono ancora sufficientemente numerosi per una dettagliata valutazione dell’accuratezza diagnostica del test e ulteriori studi sono necessari per definire un valore soglia.

Identificazione dell’agente patogeno

Esame colturale

L’identificazione del microorganismo responsabile dell’infezione e del suo profilo di sensibilità/resistenza agli antibiotici è fondamentale per un appropriato trattamento del paziente. L’esame colturale del liquido sinoviale può essere condotta sia in fase pre-operatoria che intra-operatoria. In entrambi i casi eventuali terapie antibiotiche in corso devono essere sospese per almeno 15 giorni prima del prelievo, in modo da aumentare la sensibilità dell’esame colturale che risulta insoddisfacente (45-75%), soprattutto nel caso di infezioni croniche, causate principalmente da microorganismi a bassa virulenza, presenti in bassa carica nel liquido sinoviale e/o a lenta crescita. La sensibilità del metodo è ulteriormente ridotta dall’uso di tamponi, mentre il materiale ottimale è costituto da liquido prelevato sterilmente e inserito in un contenitore a tenuta, anch’esso sterile. È stato inoltre dimostrato che i batteri responsabili di infezione sono in grado di formare degli aggregati nel liquido sinoviale che permettono ai microorganismi di resistere all’azione degli antibiotici e del sistema immune. È stato ipotizzato come la presenza di questi aggregati limiti la sensibilità dell’esame colturale, riducendo la quantità di batteri liberi in grado di crescere in vitro. Per aumentare la probabilità di osservare una crescita microbica si raccomanda di prolungare l’esame colturale dai tradizionali 2-3 giorni a 15 utilizzando brodi di coltura per batteri aerobi e anaerobi. L’isolamento di un microorganismo è solitamente indice della presenza di infezione e pertanto la specificità dell’esame colturale risulta particolarmente elevata (88-97%).

Esame in biologia molecolare

Per ovviare alla limitata sensibilità dell’esame colturale e provvedere alla identificazione del patogeno responsabile di infezione, negli ultimi anni sono stati proposti diversi test in biologia molecolare che permettono di identificare i principali patogeni rapidamente e non risentono dell’interferenza causata da terapie antibiotiche precedenti o in corso che potrebbero impattare negativamente sull’esito dell’esame colturale. Sebbene dotati di una buona sensibilità in caso di infezioni acute, caratterizzate dalla presenza di alte cariche microbiche, questi metodi mostrano delle limitazioni nel caso di infezioni croniche. Inoltre, i diversi test presenti attualmente sul mercato non sono in grado di coprire l’ampia varietà di microorganismi che possono causare questo tipo di infezioni, dando luogo a risultati falsamente negativi. Per questi motivi, i metodi che utilizzano il sequenziamento genico (NGS) di una parte o dell’intero genoma batterico appaiono molto promettenti, essendo in grado di identificare tutti i microorganismi per i quali è nota la sequenza genomica. Tra i principali svantaggi dell’utilizzo di queste metodiche vanno annoverati la necessità di personale esperto nella manipolazione di campioni per biologia molecolare, la necessità di strumentazione non accessibile per tutti i laboratori e gli elevati costi della strumentazione, soprattutto per le tecniche di sequenziamento. Inoltre, i metodi molecolari sono deputati alla ricerca del materiale genetico del patogeno, senza fornire indicazioni sulla sua vitalità e sulla espressione di meccanismi di resistenza antibiotica, per cui potrebbero indicare la presenza di batteri non vitali o rilevare microorganismi contaminanti. Di conseguenza, i risultati forniti devono essere attentamente valutati da personale esperto e contestualizzati alla condizione clinica del paziente onde evitare approcci non corretti al trattamento del paziente.

Conclusioni

Nei prossimi anni si prevede un aumento significativo delle infezioni di protesi articolare. Tuttavia la diagnosi di queste infezioni rappresenta una vera e propria sfida per il clinico e il laboratorista, In questo scenario, l’analisi del liquido sinoviale riveste un ruolo essenziale nella diagnosi delle infezioni protesiche. Non essendo ancora disponibile un unico test dotato di elevata accuratezza diagnostica, l’approccio ottimale deve prevedere la determinazione di una serie di parametri e non può prescindere dall’identificazione dell’agente di infezione. Notevoli sviluppi sono previsti nell’immediato futuro che potrebbero consentire una diagnosi più rapida e accurata. Per questo sono necessari studi clinici ben disegnati, meglio se multicentrici, e che includano un numero elevato di soggetti.

Elena De Vecchi

Responsabile Laboratorio Analisi Cliniche e Microbiologiche - IRCCS Ospedale Galeazzi-Sant’Ambrogio Milano

Bibliografia

(McNally M, Sousa R, Wouthuyzen-Bakker M, Chen AF, Soriano A, Vogely HC, Clauss M, Higuera CA, Trebse R. The EBJIS definition of periprosthetic joint infection. A practical guide for clinicians. Bone Joint J 2021;103-B(1):18-25)